科研小技巧：如何QC RNA

如何提取组织、细胞RNA至今仍是一个热门话题。科学界许多新发现有赖于半衰期仅有5秒的低拷贝mRNA。

言归正传，我们前面讲了已经很多基本知识。如，加入变性缓冲液后快速剧烈透彻的均质化是抑制核酸酶和最大程度释放RNA的关键。还有，我们也说过不同类型样品的均质化方法，从液氮最后说到使用大型珠磨研磨设备可以用哪些研磨珠。选用哪种方法要看手上有什么设备，以及一天内要处理多少个样品。珠磨研磨法可一次性处理多个样品，样品获得同等的裂解效率，保证均一性。样品比较少的话，研钵加研杵或者手持电动均质器这类一次只能处理一个样品的方法比较合适。但是每做完一个样品都要清洗设备，就会大大增加交叉污染的风险。

我们尚未讨论过的一个话题是如何定量定性检测RNA。准确分析RNA是保证下一步实验获得可重复性结果的关键。结果要从一开始就要保持一致。

检测RNA得率：

有几种方法可以用来给RNA做定量。最常用也最便宜的莫过于Nanodrop分光光度计等紫外光吸光度的仪器。Nanodrop还有一个好处就是能提供RNA纯度信息。你可以获知代表样品中蛋白杂质含量的260/280比值，还可以通过260/230比值知道样品中是否还有其它杂质（如胍酸盐）。RNA的最佳260/280比值范围是1.8-2.1，260/230比值最好是大于1.5。下图是Nanodrop所能提供信息的图标。

需要注意的是，若RNA浓度低于特定浓度（20ng/μl），Nanodrop检测数据将不再准确。我们发现当260浓度不能与280或230平衡的时候，比值数据就会出现异常。在这种情况下，留意Nanodrop的波形图。确保所看到的峰值不是220-230或280。只有曲线中峰值在260，RNA才是安全的。

为了更好地说明问题，拿一个土壤RNA实验的图举例。你可以看到有两条曲线在230处出现峰值，然后像滑雪斜坡一样走下来。情况不妙。230处的峰值表示有盐污染，盐来源于硫氰酸胍之类用来裂解细胞核抑制RNase的组分。若未完全冲洗干净，会影响整个曲线图，260读数虚高。

黄色和绿色曲线是同时含有的大量盐、腐植酸抑制因子污染的样品。腐植酸从230处大量吸光，贯穿整条曲线至320。上四个样品RNA刚提出来的时候都是棕色的。

正常的图形应该是绿色和黄色下面的曲线。在图上往230靠近是一个很漂亮的下坡，260处有峰值，然后280处再次走下坡。然后，看最底下的红色和黑色曲线，它们是纯净但浓度很低的RNA。230和280读数都很低，与260比值不等于2:1。这并不意味着RNA质量不好，从图上并未看到滑雪斜坡或者曲线走直线，RNA还是可以用的。

低浓度RNA我们还有更灵敏的检测方法。我们有时候会用Ribogreen Kit和Qubit机器。Ribogreen染色法的好处是它只检测RNA。在使用极其方便的同时，它只并不能提供RNA完整性和纯度方面的信息。在前面的文章里，我们已经拿质粒样品对比讨论过了紫外分光光度法和荧光燃料法定量检测DNA的异同。要获得比较数据，请点击上述链接查看相关文章。

检测完整性：

除了RNA的得率，评价RNA提取的好坏还得看完整性。完整性意味着RNA的完整或未被降解程度。通常我们会看电泳条带中rRNA的浓度。真核细胞的28S的浓度应该是18S的两倍，细菌要看的23S和16S rRNA条带。只需简单地跑一个5-10μl 样品标准1% DNA琼脂糖凝胶就可以。只是快速检测RNA完整性，没必要跑变性凝胶。下面是PowerLyzer UltraClean Tissue and Cells RNA Kit提取到的老鼠肝脏RNA电泳图。

肝脏RNA含量非常高，所以只加了5μl跑胶。若RNA点样太多，反而不容易把条带跑开。

高质量的RNA，上层28S条带应该比下面的18S条带要浓2倍，而且条带略弯和非常清晰。样品均质化步骤做得好的话，上面的DNA在凝胶上将不会有。若28S条带跟18S的浓度差不多，表示样品稍微有些降解。28S与18S的模糊段是mRNA。而其它段的弥散带不是个好现象。

还有安捷伦的Bioanalyzer可以分析RNA的完整性。这款机器非常好用，只需要1~2μlRNA样品，通过给出RIN数字告知rRNA条带的大小。借此RNA Intergrity Number（RIN）数值可以直观地比较不同样品提取的RNA。

这里是安捷伦Bioanalyzer分析的一份结果。该肝脏RNA样品在分析前需要用了Eukaryotic Total RNA Nano Series II kit处理。RIN值表明了用珠磨研磨法的MOBIO UltraClean Tissue and Cells RNA Kit 提取的RNA与同样适用硅胶离心柱的另一竞争品牌试剂盒的区别。

Bioanalyzer图谱的X轴从左往右，数字越大表示片段越大。45-50之间的片段是28S rRNA，41-42的是18S。如RNA出现了降解，图上会在35-40甚至更靠前的位置出现亮点或峰值。RNA片段越大，峰值越靠右。若RNA中有基因组DNA污染，它会在右边出现峰值。

关于Nanodrop 和 Agilent Bioanalyzer的更多细节，已由Biomedical Genomics整理并发布在这里。

并不是每个人都能在实验室里开动Agilent Bioanalyzer的。机器本身就非常昂贵，还有用来分析RNA用的试剂盒也不便宜。如果附近有中心实验室，也许可以借来用一下，不过肯定需要支付试剂盒的费用。

所以，这就是为什么这是个"选择"。跑个电泳和分光光度法测一下RNA的质量和得率有多高更实际。

DNA污染：

尤其是研究微生物基因的，因为引物没法设计成跨外显子接头，RNA中的DNA污染就会很令人头痛。On-Spin Column DNase removal systems在RNA洗脱前能高效地去除DNA。让DNase渗入到滤膜中，在RNA洗脱前消化并去除DNA。但通常处理时间比较长。如果样品或者细胞是储存在RNALater或RNAProtect Bacteria Reagent里头的话，DNA就更加不容易被DNase消化。这种情况下，更适合用DNase溶液处理。DNase可以与DNA充分接触，而不用隔着滤膜奋力寻找DNA。但有个不好的地方是，在PCR前必须用EDTA或加热法灭活。为了解决这个问题，我们开发出了DNase Max™ Kit，一款室温也能稳定保存的高效DNase。可以用特别的DNase吸附树脂轻易出去。对宝贵的RNA极其温和，DNase的去除也极其高效。

相关文献：

UltraClean Tissue & Cells RNA Isolation Kit

Splice-Mediated Motif Switching Regulates Disabled-1 Phosphorylation and SH2 Domain Interactions

Zhihua Gao, Ho Yin Poon, Lei Li, Xiaodong Li, Elena Palmesino, Darryl D. Glubrecht, Karen Colwill, Indrani Dutta, Artur Kania, Tony Pawson, and Roseline Godbout

Mol. Cell. Biol., Jul 2012; 32: 2794 – 2808.